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高效液相色譜儀（HPLC）操作使用步驟

核心原則： 不同品牌和型號的 HPLC，操作細節會有點差異，但核心思路和操作邏輯是相通的。記住 “開機先沖洗，關機要沖凈” 這條老規矩，準沒錯。

一、 分析前的準備（“兵馬未動，糧草先行”）

流動相準備：

溶劑選擇：得用 HPLC 級或更純的溶劑，不然雜質容易干擾，基線也會亂糟糟。

水的純度：用 18.2 MΩ?cm 的超純水，好現用現制，以免久放的水里滋生微生物損壞色譜柱，影響檢測。

過濾：所有流動相使用前一定要用 0.45 μm 或 0.22 μm 的濾膜真空抽濾，把小顆粒濾掉，不然堵了系統或色譜柱，麻煩就大了。

脫氣： 流動相里的氣泡得除掉，不然泵或檢測器里冒泡，壓力不穩，基線也會跳。常用的方法有在線脫氣、超聲、氦氣鼓泡、抽濾等。

樣品準備：

樣品得溶徹底，溶液要清亮，不能有固體顆粒。

建議用和流動相初始比例差不多的溶劑溶樣品，不然容易出現溶劑效應，峰形會變丑。

特別提醒： 樣品溶液上機前，一定要用 0.22 μm 的針頭過濾器濾一下。

色譜柱檢查：

確認所用的色譜柱類型（C18、C8、氨基柱等）與分析方法、樣品性質等是否對得上。

看看柱效卡，色譜柱的柱效和壓力應該在能接受的范圍內。

檢查實驗室環境：

廢液瓶得有足夠空間，電源、氣體（需要的話）都得正常。

二、 開機、沖洗與平衡系統（“熱身運動”）

正確開機順序：

打開電腦→開儀器電源（讓各模塊通電）→啟動工作站軟件。

這么做是為了讓軟件順利識別并連接各個模塊，少出岔子。

安裝色譜柱與系統沖洗：

把色譜柱接到流路里，注意色譜柱標簽上的箭頭應與流動相流向一致。

關鍵步驟： 先用低流速（比如 0.2-0.5 mL/min）開泵，用當前方法需要的流動相比例，慢慢調到工作時的流速。這樣能避免高壓沖擊壞色譜柱和系統。

檢查各個接口有沒有漏液。

系統平衡：

保持工作流速，讓流動相一直沖洗色譜柱和整個流路，直到：

基線平穩： 工作站上的信號線成一條直線，不漂移、沒毛刺。

壓力穩定： 系統壓力波動一般要小于 ±1%。

平衡時間通常 10-30 分鐘，梯度方法可能得更久。

三、 方法設置與樣品分析（“核心執行”）

創建/調用方法： 在色譜工作軟件里把參數設準，包括流速、流動相比例、柱溫箱溫度、檢測波長、運行時間、進樣量等。

基線觀察： 確認基線穩定后，再準備進樣。

進樣操作（沒有進樣觸發分析啟動功能的手動進樣方式）：

用合適的進樣針，先用樣品溶液潤洗幾次，再吸入比進樣量稍多的體積。

把進樣閥扳到 “Load” 位置，針完全插進進樣口，快速把樣品注進去，然后拔針。

隨后立即把進樣閥扳到 “Inject” 位置，同時在工作站上點 “Start” 開始采數據。

注意： 動作得快、銜接要順，別在 “Load” 和 “Inject” 之間停太久。

四、 關機與維護（善后工作不能馬虎）

系統沖洗（重要的一步?。?/span>

分析結束后，可千萬別直接停泵。

根據使用的流動相的類型，選合適的溶劑把系統徹底沖干凈。

如果用了緩沖鹽： 先用高比例水（比如 90% 水）沖 30-60 分鐘，把鹽分洗掉；再用高比例有機相（比如 90% 甲醇或乙腈）沖 30-60 分鐘，把水分換掉，免得滋生微生物或析出鹽。

如果沒?緩沖鹽： 直接用90% 甲醇或乙腈高比例有機相沖 30 分鐘以上就行。

正確關機順序：

停泵→關檢測器燈（尤其是 UV 燈，能延長壽命）→關工作站軟件→關儀器電源→后關電腦。

色譜柱保存：

卸下色譜柱，兩端蓋上塞子，按說明書要求存（反相色譜柱一般存純甲醇或乙腈里）。

登記記錄： 填好儀器使用記錄，寫上使用人、樣品、方法、儀器狀態這些，方便以后查詢。

HPLC 使用常見問題（Troubleshooting）及解決方案